Пока Набонид был занят активной внешней политикой на западе, у восточных границ Вавилона появился могущественный и решительный противник. Персидский царь Кир II, который уже завоевал Мидию, Лидию и многие другие страны до границ с Индией и имел в своём распоряжении огромную и хорошо вооружённую армию, готовился к походу против Вавилонии. Набонид вернулся в Вавилон и приступил к организации обороны своей страны. Однако положение Вавилонии стало уже безнадёжным. Поскольку Набонид стремился сломить могущество и влияние жрецов бога Мардука и пренебрегал религиозными праздниками, связанными с его культом, влиятельные жреческие круги, недовольные своим царём, были готовы помочь любому его противнику. Вавилонская армия, истощённая в многолетних войнах в Аравийской пустыне, не смогла отразить натиск во много раз превосходящих сил персидской армии. В октябре 539 г. до н. э. Вавилония была захвачена персами и навсегда утратила свою независимость.